微生物限度过滤的所有验证方法的操作都需要在阳性接种间完成。

**、霉菌和酵母菌计数法的验证

验证方法 取试验可能用的*低稀释级供试液进行验证。验证试验至少应进行 3 次**的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。

    1.常规法

    就是取1∶10的供试液lml和 50~100个试验菌株加入到1个平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平        皿，培养，计算各菌株的回收率。

    常规法做一个样品的**、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢?

        试验组∶5×2=10个，即每个菌株做2ml共需10个

        菌液组∶5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株2个皿        共24个

        本底菌组∶2个**计数，2个霉菌和酵母菌计数

    **计数验证所用的平皿共14个，其中6个用于试验组计数，6个用于菌液组计数，2个用于**本底菌计数，倾倒营养琼脂培养基;霉菌和酵母菌计数所用的平皿共10 个，其中4个用于试验组计数，4个用于菌液组计数，2个用于霉菌本底菌计数，倾注玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）。

    回收率=【（试验组菌数-本底菌组菌数/菌液组菌数】

    当大肠埃希菌，金**葡萄球菌，枯草杆菌3个菌株的回收率均达到70%以上时，**计数用该验证的方法检验。

    当白色***和黑曲霉 2个菌株的回收率均达到70%以上时，霉菌计数用该验证的方法检验。

    2.培养基稀释法

    取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定**、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液 2ml，每lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每lml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为 1ml的菌落数，计算每 1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数;控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

    具体操作∶（以1ml分至5个皿为例）

    就是取1∶10的供试液 1ml均匀分注到5个平皿中，每个皿0.2ml，每株试验菌平行制备 2ml的平皿数，然后加入相应的琼脂培养基，培养，计算各菌株的回收率。

    用该法做一个样品的**、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢?

        试验组∶5×10=50个，即每个菌株做2ml共需50个

        菌液组∶5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株 2个皿       共80个

        本底菌组∶10个**计数，10个霉菌和酵母菌计数

    3.离心沉淀集菌法

    取一定量的供试液，3000转/分离心 20分钟（供试液如有沉淀，先以 500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。然后用此稀释液进行检验。

    4.薄膜过滤法

    取相当于每张滤膜含1g 或lml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每 1g 或 lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液 lml，过滤。用 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或**琼脂培养上。每种菌株至少制备一张滤膜。即每个验证样品至少制备7个膜。（5个试验组和 2个本底菌）