计数法的检验

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的**、霉菌及酵母菌菌数的测定。

1.平皿法

常规法和培养基稀释法都是平皿法。供试液通过离心沉淀以后也可用平皿法检查。

采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。取供试液1ml，置直径 90mm 的无菌平皿中（培养基稀释法，则将 1ml供试液均匀分注入2个或以上的平皿中），注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混人，凝固。倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验 取试验用的稀释液 lml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

培养和计数 除另有规定外，**培养 48 小时，逐日点计菌落数，一般以 48小时的菌落数报告∶霉菌、酵母菌培养 72.小时，逐日点计菌落数，般以72 小时的菌落数报告;必要时，可适当延长培养时间至5~7天进行菌落汁数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用士**计数∶ 改瑰红钢琼脂培养基用干霉菌及酵母菌计数;酵母浸出粉胨陈葡萄糖琼脂培养基用干酵母菌计数。在特殊情况下， 若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有**，则应分别点汁霉菌和酵母菌、**菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的**数，与玫现红钠琼脂培养基中的霉菌和整母菌数或营养琼脂培养基中的**数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。

菌数报告规则 宜选取**、酵母菌平均菌落数在 30～300 之间、霉菌平均菌落数在 30～100 之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

（1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（2）当同时有 2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数;若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数;当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。

（3）当各稀释级的平均菌落数均小于 30，以*低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅*低稀释级的平板有菌落生长，

但平均菌落数小于1时，以<1乘以*低稀释倍数的值报告菌数。

薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为 50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法**。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的*大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

操作步骤

取相当于每张滤膜含 1g 或lml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每 1g 或 Iml 所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液 lml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同"计数方法的验证"。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

阴性对照试验 取试验用的稀释液lml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过 100 个。

菌数报告规则 以相当于1g 或 lml供试品的菌落数报告菌数;若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以*低稀释倍数的值报告